Hybridoma Serum Free Medium

杂交瘤细胞无血清培养基是一种无血清的完全培养基，适合多种杂交瘤细胞的生长和单克隆抗体的生产。 本产品使用注射用水（Water-For-Injection）配制。 本产品含有：酚红、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠。 产品参数 本产品为过滤除菌产品 物理外观：红色澄清液体 内毒素：≤3 EU/mL 渗透压：270 ~ 340 mOsm/kg·H20 pH值：7.0 ~ 7.4 使用说明： 一、使用指南 1、使用时请穿戴合适的安全手套、实验服和护目镜。 产品不能用于人体。 2、细胞直接接触的环境必须是无菌的，用于细胞培养的试剂必须是无菌的。 请在无菌环境中进行细胞实验，任何器皿或工具，移入无菌环境之前，应在入口处去除外包装并使用酒精搽拭进行消毒。 二、 制备培养基 1、杂交瘤细胞无血清培养基含有L-谷氨酰胺、重组胰岛素、重组转铁蛋白以及表面活性剂，可以直接使用。 2、如需培养胆固醇依赖的细胞系，请使用胆固醇。 3、不推荐使用抗生素。如果需要，可加入除卡那霉素和新霉素以外的抗生素，比如盘尼西林、链霉素、庆大霉素、林可霉素、抗支原体试剂和抗真菌剂。 4、培养基准备完全后，请在2 ~ 8 ℃下避光保存，开瓶后尽快使用完毕。 三、细胞培养的条件 1、培养基：杂交瘤细胞无血清培养基 2、细胞系：杂交瘤细胞 3、细胞类型：悬浮细胞 4、培养容器和设备：摇瓶、生物反应器或CO₂恒温摇床 5、培养条件：36 ~ 37 ℃，CO₂含量5~10%的湿润空气，避光。实验前应对细胞培养仪器进行温度和CO₂含量的设置。 四、复苏 以下实验方案，均以125mL锥形瓶为例。 以一管冻存细胞体积1.5mL，活细胞密度0.5×10⁷~1×10⁷个/mL 为例： 1、准备无菌的培养容器（125mL锥形瓶），在容器中加入28.5mL预热的完全培养基，然后立刻开始冻存细胞的解冻； 2、在 37 ℃水浴中，迅速（ 3、轻轻吸出管中内容物，并转移到第1步预先准备好的锥形瓶中，采用合适的封闭材质封闭瓶口，确保适当的气体交换； 4、将锥形瓶放到摇床中，设置转速120~140rpm，进行细胞培养； 5、细胞复苏2~3天后，挑选对数生长期的细胞进行传代；推荐以3×10⁵个/mL的活细胞密度进行传代，传代3次后再进行细胞应用。 注意：由于复苏的细胞非常脆弱，一般无需离心去除DMSO。 五、悬浮细胞传代 推荐在细胞传代30次或者持续3个月以上时，复苏新的冻存细胞进行传代。 推荐当细胞满足以下条件时进行传代： ①、对数生长期 ②、细胞活率大于90% ③、活细胞密度达到~2×10⁶个/mL 传代步骤： 1、离心收集细胞（100×g，5~10分钟）； 2、使用少量预热培养基重悬细胞，进行细胞计数，确定细胞活率，计算活细胞密度； 3、在无菌的培养容器（125mL锥形瓶）中加入合适体积的预热的完全培养基；然后立即以3×10⁵~5×10⁵个/mL 的最终活细胞密度，把细胞接种入锥形瓶中； 4、将锥形瓶放到摇床中，设置转速120~140rpm，进行细胞培养； 5、当活细胞密度达到2×10⁶个/mL时，可以进行传代； 注意：悬浮细胞传代过程最好使用上面推荐的步骤，也可以不离心，直接细胞计数然后添加预热的新培养基分瓶培养。但是为减少细胞代谢物和碎片在培养基中的积累，进而影响细胞活性，每1~2周应该彻底更换一次培养基。 如果距复苏或者上次传代已满5天，活细胞密度仍然不达要求，请彻底更换培养基,或者复苏新的冻存细胞。 六、细胞驯化 细胞驯化指细胞从不同培养基或者不同培养方式中转换的过程。此处指从含血清培养基转到无血清培养基（SFM）中生长的适应过程。 推荐当细胞满足以下条件时进行传代： ①、对数生长期 ②、细胞活率大于90% ③ 活细胞密度达到~1×106个/mL 驯化成功的标准：每4~6天，活细胞密度可达2×106个/mL，细胞活率在90%以上，细胞的比生长速率与驯化前一致。 下述步骤，待替换的培养基称为A；目标培养基称为B。 直接驯化，即细胞直接从A转换到B中培养。 1、离心收集细胞（100×g，5~10分钟）； 2、使用少量预热的B重悬细胞，进行细胞计数，确定细胞活率，计算活细胞密度； 3. 在无菌的培养容器（125mL锥形瓶）中加入合适体积的预热的B；然后立即以3×105~5×105个/mL的最终活细胞密度，把细胞接种入锥形瓶中； 4、后续传代，继续采用此接种密度，直到驯化成功。 注意：如果直接驯化3~5代后细胞表现不佳，仍未达到驯化成功标准，请采用间接驯化法。 间接驯化，即分几步把细胞从A转换到B中培养。与直接驯化相比较，间接驯化带来的培养条件变化更加温和。 与直接驯化传代操作步骤1~4相同，过程中使用的培养基为按照下图方案配置的混合培养基，最后一次驯化则用100 %B（一定要确定细胞在当前浓度的混合培养基中生长情况达到前述的驯化条件，才能进行下一步培养基的更换）： 5、继续监控细胞生长3~5代，直到驯化成功； 6、驯化过程最后一次传代时，采用2×10⁵~3×10⁵个/mL 的最终活细胞接种密度即可。 注意：在驯化过程中，最好不要让细胞过度生长。推荐在驯化成功前，做好原始培养物的备份；间接驯化时，每次适应新比例的混合培养基之前，做好当前培养物的备份。 七、细胞冻存 推荐采用对数生长期且细胞活率大于90%的细胞进行冻存。 推荐准备足够的细胞培养物，保存适量条件培养基。 1、准备冻存培养基（45%新鲜的完全培养基+45%条件培养基 +10 %DMSO），并在 2~8 ℃避光条件下预冷（不超过24小时）。 2、进行细胞计数，计算细胞密度，细胞活率和活细胞密度 （ρ1）；然后根据待保存的细胞数（n），计算需要离心收集的细胞培 养物的体积（V1），以及所需的冻存培养基的体积（V2）。一般冻存时的活细胞密度（ρ2）为0.5×10⁷~1×10⁷个/mL。V1= n/ρ1，V2=n/ρ2。 3、离心（100×g，5~10分钟）V1体积的培养物收集细胞，除去上清；使用V2体积预冷的细胞冻存液将细胞重悬； 4、根据后续使用需求，将上述细胞重悬液分装到细胞冻存管中（一般1.5mL每管）； 5、在冻存管上做适当标识（例如细胞名称、冻存时间及操作者）； 6、可使用程序化降温仪或者人工控制细胞的温度下降（标准的冻存降温速率为-1～-2 ℃/min）。当温度达-25℃以下时，温度降速可增至-5～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中； 7、人工降温的操作方法可以是：将细胞冻存管放入含有异丙醇的冻存盒中，置于-20℃冰箱2小时，然后置于-80℃冰箱中过夜，最后单独取出冻存管移入液氮容器内。 注意：细胞冻存24小时之后，或者长期冻存（比如半年后），应进行细胞复苏能力检测。 注意事项： 本产品供科学研究和生产使用，用于组织和细胞的体外培养。严禁用于临床。

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