HiFi Seq DNA 聚合酶

热激条件：95℃，3 min 外切酶活性：3’→5’ 扩增重数：单重/多重 荧光定量RT-PCR：√ 额外添加AT载体连接：√ 推荐项目：RNA病毒定量、cDNA合成、RNA测序 产品说明： HiFi Seq Hotstart DNA polymerase 是通过基因工程改造的工程酶，在无需辅助蛋白及额外的 DNA 结合功能域的条件下提高了对 DNA 模板的亲和力。相比于其他野生型的 B 族 DNA 聚合酶，HiFi Seq Hotstart DNA 聚合酶强大的持续合成能力能够显著的提高扩增产物量、扩增速率以及灵敏度，同时长片段扩增和复杂模板的扩增能力(高 AT 或者高 GC 模板)也有明显的提高。 HiFi Seq Hotstart DNA polymerase 有 5’→3’聚合酶活性和 3’→5’外切酶活性(校对活性)，无 5’→3’外切酶活性。强大的3’→5’外切酶活性保证了 DNA 扩增过程中的准确率，HiFi Seq Hotstart DNA polymerase 保真性是野生型 Taq DNA 聚合酶的100 倍，是其他 B 族 DNA 聚合酶的 10 倍。 产品特点 1、扩增效率高，能够在较少的循环数下得到较高的产物量； 2、保真性高、无明显的碱基偏好性； 3、灵敏度高，可对低至 1ng 起始模板进行富集。 产品内容 HiFi Seq Hotstart DNA polymerase（1U/ul） 5×HiFi seq buffer 10×Enhancer 适用范围 NGS DNA 文库的富集、基因表达克隆、基因定点突变、细胞内基因点突变的分析 PCR 扩增操作流程 1、提前取出 5×HiFi seq buffer、10×Enhancer 置于室温融化，如果有沉淀析出，请彻底混匀溶解后使用，HiFi Seq Hotstart DNA polymerase 置于冰上备用。 2、按照下表配制 PCR 体系，注意此步骤需于冰浴中操作。 1）反应体系可以设置在 10-50μl 之间，试剂使用量可以按照比例调整，不推荐使用>50μl 体系； 2）1×HiFi seq buffer 包含 2.5mM Mg2+(1×)，如果体系需要更高浓度的 Mg2+可以额外的添加； （！请注意Mg2+的2+为上角标） 3）在初次测试时，50μl 反应体系建议基因组模板使用量为 10-100ng，稍微复杂模板使用量为 0.1-1ng。 3、按下表设置 PCR 仪反应程序，开启热盖，温度设置于 105℃。 1）预变性时间 95℃ 3min 对于常规模板是足够的，对于 GC大于等于70%模板建议将预变性时间延长至 5min； 2）体系中高盐离子浓度会影响 DNA 溶解，为保证复杂 GC 模板能够完全变性，建议将变性温度调整到 98℃。高盐 buffer 同时也会影响引物的退火，优化后的退火温度要略高于常规的 PCR 体系，初次反应建议使用 56℃为退火温度,若反应不理想,则可以每调整 3℃测试一次的方法来确定最适的退火温度； 3）两步法扩增程序，建议退火/延伸范围 65-68℃，延伸时间按 30-60 sec/kb 计算； 4）常规条件下目的片段小于等于1kb，延伸时间按 15sec/kb 计算，当目的片段>1kb，或者要提高产物量，延伸时间按 30 sec/kb 计算； 5）为获得较高的保真性，建议扩增循环数小于等于25cycles，扩增循环数越高，错配率越高。

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