UltraBio™ sf9 Expression System (Plus)

UltraBio™ sf9 表达系统（Plus）可利用Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统进行杆状病毒及重组蛋白的大规模表达与生产。 1. 专门针对 细胞设计的无血清培养基，适用于 sf9 细胞的长期、稳定、高密度悬浮培养； 2. 亦可用于High Five 细胞培养及蛋白表达； 3. 本产品含有 L-Glutamine，一般无需额外添加； 4. 本产品适用于基于细胞培养的大规模生物药生产及科学研究，但不可直接用于人体或作为药物使用。 细胞复苏 1. 在37 ℃水浴中快速融化冻存的细胞至仅剩米粒大小的冰晶； 2. 将冻存管中的细胞液全部转移到含有25ml SF Vir-exp CDM（预热至2 7 ℃ ） 的125ml摇瓶中； 细胞在复苏时可适当减少培养基体积至 15-20ml，提高细胞增长速度。 3. 放入 27 ℃ ，转速 90-110 rpm（振幅 50mm）的摇床中进行培养； 4. 细胞需经过 次以上传代方可完全复苏至正常状态。正常状态的细胞应当达到 天从0.5-1×10⁶ cells/ml 生长至 4 ×10⁶ cells/ml 的生长状态。复苏过程的前 2-3代出现细胞活率（Viia）＜70％的情况，或细胞增长缓慢（4-6 天代传）均为正常现象。 细胞传代 1. 取细胞密度达到 (3-4) ×10⁶ cells/ml，细胞活率 ≥85 ％，处于对数生长期的种子液进行传代； 2. 无菌转移所需量的种子液接种至盛有 27 ℃ SF Vir-exp CDM 的摇瓶中；推荐接种密度为 0.5-1×10⁶ cells/ml； 3. 将摇瓶放入 27 ℃， 转速 90-110 rpm （振幅 50mm）的摇床中进行培养。 [按上述步骤每2-3天进行传代培养。] 细胞冻存 1. 准备处于对数生长期，活率＞90 ％的细胞； 2. 按照冻存密度、冻存前种子密度及冻存体积，计算确定所需种子液的量，冻存密度建议在 (1.5-2) ×10⁷ cells/ml; 3. 准备细胞冻存液：将CryoStasis™ 组织/细胞冻存液置于2-8 ℃预冷备用； 若自行配制冻存液，可使用 90.0％ SF Vir-exp CDM＋1 0.0％DMSO, 使用前无菌过滤。 4. 无菌移取所需体积的种子液于离心管中，200×g 离心分钟； 5. 加入预冷的冻存液重悬细胞，快速分装细胞至冻存管中，每管1.0-1.5ml； 6. 将冻存管放入程序降温盒（异丙醇降温盒），置于-80 ℃冰箱中保存。若需长期储存，可在 -80℃ 冰箱存放12-24h后转移到液氮中保存。 病毒包装与蛋白表达 1. 种毒制备： 病毒 1.1 制备细胞培养液： 准备细胞培养专用 孔板，每孔取8 ×10⁵个处于对数生长 期，活率大于 95％ 的sf9细胞，用 2ml SF Vir-exp CDM 混匀后加入板孔中； 将细胞培养专用孔板放入 27 ℃培养箱静置 ，促进细胞进入半贴壁状态； 使用其他细胞培养平皿时按皿底面积等比例放大或缩小。 1.2 配置体积为培养体积 5 ％的病毒包装质粒稀释液： 每 8×10⁵ 个细胞建议转入2-3μg质粒。对于2ml的培养物，可用100μl SF Vir-exp CDM 稀释 2.5μg 质粒，轻轻混匀后加入 5μl EelTrans 增强剂，用移液器轻轻混匀，制成质粒稀释液； 1.3 配置体积为培养体积 5％ 的 EelTrans 转染试剂稀释液： 每μg质粒建议使用1- 5μl EelTrans 转染试剂。对于2ml 培养物，可用 100μl SF Vir-exp 稀释 7.5μl EelTrans 转染试剂，涡旋混匀； 1.4 配置质粒转染试剂 复合物： 将以上配置的质粒稀释液加入转染试剂稀释液中，轻轻混匀，室温下孵育10分钟； 1.5 细胞转染： 将 质粒 转染试剂 复合物缓慢加入待转染的细胞培养液中，轻轻混匀，在 或直到发现病毒感染的迹象。病毒包装后，细胞涨大或部分裂活率（Via）一般为20-40 ％; 1.6 病毒收集： 收集含有病毒的培养物，500×g离心 分钟去除细胞和大碎片。收集上清，用0.22μm滤膜过滤后，将含有病毒的滤液转移到新的离心管中，测定病毒滴度，2-8℃ 避光保存； 2. 病毒扩增：P1 病毒 2.1 制备10-200ml 密度为(1-2 )×10⁶ cells/ml，处于对数生长期，活率大于90 ％的sf9 细胞悬浮培养液； 2.2 以 P0 病毒加入细胞培养液，27℃下孵育48-72小时，细胞活率为20-40 ％时按 P0 病毒 制备方法收集病毒。病毒接种的MOI建议为0.05-0.1； 2.3 按以上方法可进一步扩增病毒，制备 代病毒。蛋白表达时建议使用病毒滴度为 或以上的病毒种液感染细胞。病毒扩增代次限制在 代以内以降低突变几率； MOI定义为每个细胞感染病毒的活性单位数，用以下公式计算病毒接种量 3. 蛋白表达 3.1 制备密度为 (1 .5-2.5)×10⁶ cells/ml，处于对数生长期，活率大于90 ％的细胞悬浮培养液； 3.2 以 MOI＝5-10加入病毒种液感染细胞，置于27 ℃ ，转速90-110rpm （振幅 50mm）的摇床培养。细胞活率为20-40 ％时即可收获蛋白。 注意事项 为了保护您的安全与健康，实验中请全程穿戴好实验服和一次性手套，并注意通风橱操作。

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