pCMV-GFP-p62

pCMV-GFP-p62是阿拉丁自行研发的在哺乳动物细胞中表达GFP标签的人源p62融合蛋白的质粒，该质粒含有CMV启动子，为卡那霉素抗性，转染细胞后能够在靶细胞中高效表达绿色荧光蛋白GFP标签的p62融合蛋白，呈现明亮的绿色荧光，可以用于细胞自噬(autophagy)的研究。本质粒转染细胞后，可以使用G418筛选稳定表达融合蛋白的细胞株。p62也称sequestosome I (SQSTM1)，在多细胞生物(不包括植物和真菌)中高度保守，主要分布于细胞质，也可以定位于细胞核、自噬体(autophagosome)和溶酶体(lysosome)中。p62是一种应激诱导的蛋白，可以作为信号枢纽(signaling hub)在氨基酸感应(amino acid sensing)和氧化应激等许多细胞事件中发挥重要作用，并且还可以作为PKC、ERK1、mTORC1、NF-кB和caspase-8等的支架蛋白而参与相应的信号转导。p62全长440个氨基酸，包含一个PB1(Phox1/Bem1p)结构域，一个锌指结构域(ZZ)，两个核定位信号(NLS1和NLS2)，一个TB (TRAF6 binding)结构域，一个LIR结构域(LC3-interacting region)，一个KIR结构域(Keap1-interacting region)，和一个C端的UBA(Ubiquitin-associated)结构域。N端的PB1结构域负责p62寡聚化以及与其它含PB1结构域的蛋白相互作用。UBA结构域对于寡聚化的p62形成蛋白聚集体是必须的，特别是当细胞暴露于氧化环境中，其作为信号组织中心负责招募泛素化修饰的蛋白底物。作为支架蛋白，p62通过其UBA结构域与蛋白聚集体(protein aggregate)相结合并将其导向自噬体从而将其降解。LIR结构域含有一个富含酸性氨基酸和疏水氨基酸的簇(DDD和WxxL)，该酸性簇和LIR结构域的其它两个关键氨基酸Trp338/Leu341可与LC3蛋白中的多个位点 (N端的碱性氨基酸以及LC3的ubiquitin fold表面的两个疏水口袋)相互作用。LIR结构域与Atg8/LC3的相互作用负责引导泛素化的蛋白到蛋白酶体(proteasome)或自噬体中降解。p62与LC3的荧光共定位和在免疫共沉淀实验过程中被一起沉淀(pull down)，说明它们参与了自噬过程中同一蛋白复合物的形成。在自噬起始的时候，p62与蛋白聚集体的复合物与LC3在自噬体的表面相结合，进而起始了蛋白聚集体的降解过程。p62与LC3蛋白的相互作用对于p62自身的自噬降解也是必须的，抑制自噬将导致p62的大量堆积，然后形成p62和泛素染色阳性的聚集体。Caspase-8被报道与p62相互作用，从而起始非死亡受体依赖的细胞凋亡信号通路。p62的功能异常与人类的多种疾病紧密相关，在肝功能紊乱，肿瘤和多种神经退行性疾病的病人样品中发现了异常堆积的p62聚集体。p62是蛋白聚集物(protein aggregates)中的常见组分，例如帕金森氏病(Parkinson disease)中的Lewy body，艾滋海默病的神经纤维缠节(neurofibrillary tangles)，Huntingtin disease病人的huntingtin aggregates中均含有p62。在佩吉特氏骨病(Paget's disease of bone)，肌萎缩性脊髓侧索硬化症 (amyotrophic lateral sclerosis)以及额颞叶变性(frontotemporal lobar degeneration)等疾病中都有p62的突变被报道。自噬(Autophagy)是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。自噬与多种生理功能有关，在饥饿等不利的环境条件下，细胞通过自噬降解多余或异常的细胞内组分，为细胞的生存提供能量及原材料，促进生物体的生长发育、细胞分化及对环境变化产生应答。自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。由于细胞自噬在生理和病理过程中都有重要作用，自噬已经成为细胞生物学领域的一个新的研究热点。在用pCMV-GFP-p62转染细胞后，荧光显微镜下GFP-p62通常以绿色点状 (puncta)或较为弥散的斑块状(speckles)荧光存在于细胞质和细胞核中。在自噬被抑制的情况下，这种绿色的点状或斑块状物其大小会变大而且数目会变多。p62的荧光标记对于自噬的诱导、自噬的抑制以及蛋白聚集体的清除都是一个非常好的研究工具。pCMV-GFP-p62质粒的主要信息如下： pCMV-GFP-p62质粒(6349bp)的图谱如下： pCMV-GFP-p62中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pCMV-GFP-p62)包括： pCMV-GFP-p62中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pCMV-GFP-p62 once)包括： pCMV-GFP-p62质粒中推荐使用的测序引物序列如下：T3 primer(620-639): 5′-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3′T7 primer (2851-2872): 5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′pCMV-GFP-p62的全序列信息请参考阿拉丁网站上该质粒的信息。 注意事项 ： 本质粒未经阿拉丁书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明 ： 1.首次使用时请先取少量本质粒转化大肠杆菌，进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定，或通过测序进行鉴定。2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl，共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。

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