Human RPL30 qPCR Primer Pair

人类 RPL30 qPCR 引物对

Human RPL30 qPCR Primer Pair

H746975-1000T

1000T

-20°C储存,避免反复冻融

超低温冰袋运输

-20℃保存。建议复溶后进行适当分装，避免反复冻融。

Human RPL30 qPCR Primer Pair，即人RPL30 qPCR引物对，主要用于基于SYBR Green的qPCR、One-Step qRT-PCR或semi-quantitative PCR。本引物为预先设计、经过qPCR验证、预混的引物对。qPCR (Quantitative PCR)即定量PCR，也称实时荧光定量PCR或实时定量PCR (Real-time quantitative PCR)、实时PCR (Real-time PCR)，是一种在DNA扩增反应过程中，以荧光定量测定每个聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。qPCR常用的两种方法是SYBR Green等荧光染料法和探针法。SYBR Green等荧光染料法是使用带有荧光的、非特异的DNA结合染料SYBR Green等以检测PCR过程中积累的PCR扩增产物；而探针法(Probe method)，也常被称为TaqMan探针法，不使用荧光染料，而采用荧光基团和淬灭基团(Quencher)标记的DNA探针靶向拟通过PCR检测的目标序列1,2]。对于SYBR Green等染料法，引物至关重要。本系列引物产品采用阿拉丁开发的引物设计算法，优化了序列并经过验证，特异性佳，扩增效率高，引物二聚体形成发生率低，qPCR数据可靠；本系列引物对一般都跨外显子(Span exon junctions)，避免了对基因组DNA (gDNA)的扩增3,4]；本系列的引物产品非常丰富，几乎包含了所有人和小鼠的基因；引物的Tm值约60ºC，大多数扩增产物(Amplicon)的长度约90-160bp。同时阿拉丁还提供针对各个信号通路的引物组合(Primer Panel/Primer Array)。本产品为预混冻干粉，每管含正向引物(Forward primer，也称上游引物)和反向引物(Reverse primer，也称下游引物)各1nmol，共2nmol，不含核酸酶(Nuclease-free)，只需加入400μl超纯水溶解成2.5μM each，即可使用。按20μl或25μl体系使用2μl引物，本产品每管可以用于200次qPCR实验。 注意事项 ： PCR扩增产物的长度可能会因基因转录后存在多种剪接形式而有所差异。虽然本系列引物产品的特异性非常好，但仍建议进行熔解曲线(Melt curve)分析以确定扩增反应的特异性。如果只有一个熔解曲线峰(对应的退火温度即双链DNA产物的Tm值)，说明只有一种单一产物；如果熔解曲线出现双峰、多峰或杂峰峰，可能是引物二聚体或非特异性扩增、存在基因组DNA污染、试剂及环境被污染等。建议设置不含模板的对照(No template control, NTC)，即反应体系中包含除模板以外的所有反应组分，根据样品孔和无模板对照孔熔解曲线的差异，可判断是否存在引物二聚体或其它的非特异性扩增。若反应体系存在扩增产物污染，推荐使用防污染型qPCR Mix。本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明 ： 1.PCR反应体系的设置：a.开启本产品前，3000-8000×g离心1分钟，以防开盖时引物干粉散失。每管加入400μl超纯水，先盖好盖子颠倒混匀数次，然后离心机快速离心几秒，开盖后再轻轻吹打混匀，即得400μl 2.5μM each的Primer Mix。超纯水推荐使用 Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) 。b.融解并混匀PCR反应所需的各种溶液。SYBR Green qPCR Mix需完全融解并混匀后置于冰浴上或冰盒内。推荐使用 SYBR Green qPCR Mix (2X) 、 SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit 、 SYBR Green qPCR Mix (2X, 防污染型) 或 SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit (防污染型) 。c.参考下表在室温或冰浴上设置PCR反应体系，以96孔板和 SYBR Green qPCR Mix (2X)为例。ReagentVolume for One PCR ReactionSYBR Green qPCR Mix (2X)10µlPrimer Mix (2.5μM each)2µlTemplate DNA2µlRNase-Free Water6µlTotal Volume20µl注1：通常引物的终浓度为0.2-0.5μM each时可获得良好的检测效果，也可根据情况在0.1-1.0μM each范围内调整引物的终浓度。注2：通常DNA模板的量以1-10ng cDNA为参考用量。因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，如有必要，可加大模板用量或对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。RT-PCR反应得到的cDNA直接作为模板时，其添加量不要超过PCR反应总体积的10%。注3：96孔板的推荐反应体系为20µl，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系。注4：建议设置不加模板的阴性对照组。d.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。推荐使用基础型微孔板离心机(垂直式, 2500rpm) 进行快速离心。e.将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始定量PCR反应。2.PCR反应程序：在Real-time PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95ºC 2分钟，复杂或高GC模板适当延长时间至5-10分钟。本程序是以ABI QuantStudio™ 6 Flex荧光定量PCR仪为例：a.预变性：95ºC 2分钟；b.变性：95ºC 15秒；c.退火/延伸：60ºC 15-30秒；d.重复步骤b和步骤c，总共40个循环；e.熔解曲线分析(可选)：95ºC 15秒, 60ºC 15秒, 95ºC 15秒；f.使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果。注：以上举例为常规qPCR反应系统，仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据模板、引物、目的片段的特点设定最佳反应条件，并根据比例放大或缩小反应体系。上述为两步法qPCR，如果采用三步法qPCR，只需在退火/延伸后加一步72ºC 30秒，随后重复步骤b、c及增加的这一步骤共40个循环即可。参考文献：1.Marilynn R Fairfax, Hossein Salimnia. Molecular Diagnostics. 2010. Pages 3-14.2.Cao H, Shockey JM. J Agric Food Chem. 2012. 60(50):12296-303. 3.Thornton B, Basu C. Methods Mol Biol. 2015. 1275:173-9.4.Bustin SA, Mueller R, Nolan T. Methods Mol Biol. 2020. 2065:5-22.5.Kozera B, Rapacz M. J Appl Genet. 2013. 54(4):391-406. 6.da Conceição Braga L, Gonçalves BÔP, Coelho PL, et al. Acta Histochem. 2022. 124(1):151821. 7.Laurell H, Iacovoni JS, Abot A, Svec D, Maoret JJ, et al. Nucleic Acids Res. 2012. 40(7):e51.