阿拉丁生产的Lambda Exonuclease，即λ Exonuclease，λ核酸外切酶或Lambda核酸外切酶，是一种特异性作用于DNA的5´→3´核酸外切酶，能选择性地沿5´→3´方向消化5’端磷酸化的双链DNA，对单链DNA和5’端未磷酸化修饰的DNA的酶切活性较低，不能从DNA的切刻或缺口处起始消化1, 2]。 Lambda Exonuclease对5´-0H端的切割速度比5´-P端慢约20倍；对单链DNA的酶切速度比双链DNA慢约100倍。Lambda Exonuclease是由阿拉丁自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的重组酶。阿拉丁生产的Lambda Exonuclease对一条链带有5´磷酸化修饰的双链线性DNA消化的效果参考图1。图1. 阿拉丁生产的Lambda Exonuclease 对仅一条链带有5´磷酸化修饰的双链线性DNA消化的效果图。在20µl反应体系(67mM Glycine-KOH pH9.4, 2.5mM MgCl2, 50µg/ml BSA)中，加入5pmol 26bp双链线性DNA片段(其中一条核酸链带有5´磷酸化修饰，另一条链无5´磷酸化修饰)，以及图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的Lambda Exonuclease，37℃孵育30分钟进行反应，反应完毕后加入10mM EDTA终止反应，并在75℃条件下孵育10分钟进行灭活处理。取出10μl反应产物，加入2μl 6X DNA Loading Buffer，然后进行10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。用1X TBE作为电泳液，180V电泳40分钟，之后用D0128/D0130 NA-Red (1:2000稀释)室温染色7分钟，即可拍照观察结果。如图所示，本产品与N公司的产品相比，具有类似的降解带有5´磷酸化修饰的双链线性DNA的效果。图中效果仅供参考。阿拉丁生产的Lambda Exonuclease对5´磷酸化修饰的单链线性DNA消化的效果参考图2。图2. 阿拉丁生产的Lambda Exonuclease 对5´磷酸化修饰的单链线性DNA消化的效果图。在20µl反应体系(67mM Glycine-KOH pH9.4, 2.5mM MgCl2, 50µg/ml BSA)中，加入10pmol 26nt单链线性DNA片段(5´磷酸化修饰)，以及图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的Lambda Exonuclease，37℃孵育30分钟进行反应，反应完毕后加入10mM EDTA终止反应，并在75℃条件下孵育10分钟进行灭活处理。取出10μl反应产物，加入2μl 6X DNA Loading Buffer，然后进行10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。用1X TBE作为电泳液，180V电泳40分钟；之后用D0128/D0130 NA-Red (1:2000稀释)室温染色7分钟，即可拍照观察结果。如图所示，本产品与N公司的产品相比，具有类似的降解带有5´磷酸化修饰的单链线性DNA的效果。图中效果仅供参考。阿拉丁生产的Lambda Exonuclease对无5´磷酸化修饰的双链线性DNA消化的效果参考图3。图3. 阿拉丁生产的Lambda Exonuclease 对无5´磷酸化修饰的双链线性DNA消化的效果图。在20µl反应体系(67mM Glycine-KOH pH9.4, 2.5mM MgCl2, 50µg/ml BSA)中，加入5pmol 26bp双链线性DNA片段(无5´磷酸化修饰)，以及图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的Lambda Exonuclease，37℃孵育30分钟进行反应，反应完毕后加入10mM EDTA终止反应，并在75℃条件下孵育10分钟进行灭活处理。取出10μl反应产物，加入2μl 6X DNA Loading Buffer，然后进行10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。用1X TBE作为电泳液，180V电泳40分钟；之后用D0128/D0130 NA-Red (1:2000稀释)室温染色7分钟，即可拍照观察结果。如图所示，本产品与N公司的产品相比，均不能有效的消化无5´磷酸化修饰的双链线性DNA。图中效果仅供参考。 用途 ： 生成单链PCR产物用于DNA测序；DNA单链构象多态性(SSCP)分析；滚环扩增；从双链DNA片段生成单链DNA；PCR产物的克隆；质粒制备净化。 来源 ： 纯化自携带编码大肠杆菌Lambda核酸外切酶基因的E.coli重组菌株。 酶储存溶液 ： 25mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% Glycerol, (pH8.0 @25℃)。10X Reaction Buffer: 670mM Glycine-KOH, 25mM MgCl2, 500µg/ml BSA, (pH9.4 @25℃)。 失活或抑制 ： 加入EDTA至终浓度为至少10mM，75℃孵育10分钟可使Lambda Exonuclease失活。 注意事项 ： Lambda Exonuclease的最佳反应温度是37℃，在75℃条件下孵育10分钟可使其完全失活。本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明 ： 1.参考下表在冰浴中配制反应体系(以50μl体系为例)。 Reagent Volume 10X Reaction Buffer 5μl DNA Sample Xμl (up to 5μg) Lambda Exonuclease (5U/μl) 1μl (5U) Ultrapure Water Up to 50μl Total Volume 50μl 2.移液器吹打混匀，低速离心使粘附在管壁上的液体沉降至管底。 3.反应条件：37℃孵育30分钟。 4.终止反应：加入EDTA至终浓度为10mM。 5.热失活：75℃孵育10分钟使Lambda Exonuclease失去活性。 6.将酶切消化后的产物进行琼脂糖凝胶或聚丙烯凝胶电泳分析，拍照观察并分析酶切效果。 7.如果需要进一步纯化处理后的样品，推荐使用以下几种方式之一进行纯化： a.柱纯化，推荐使用PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒进行。 b.从琼脂糖凝胶中回收DNA样品，推荐使用DNA凝胶回收试剂盒。 c.也可酌情进行苯酚/氯仿抽提，然后进行乙醇沉淀。 常见问题： 1.T5 Exonuclease与Lambda Exonuclease 有何不同？ 与Lambda Exonuclease不同，T5 Exonuclease可以降解带缺刻的环状双链DNA。T5 Exonuclease也作用于单链DNA，而Lambda Exonuclease对单链DNA的降解效率较低。 2.T7 Exonuclease与Lambda Exonuclease 有何不同？ T7 Exonuclease与Lambda Exonuclease不同，能作用于缺刻处且进行性较低，且对单链DNA的降解活性甚至低于Lambda Exonuclease。由于它的进行性较低，因此T7 Exonuclease对于单向嵌套删除可能更有用。在使用T7 Exonuclease时，可通过稀释T7 Exonuclease来控制反应速率。而在使用高度进行性的酶，如Lambda Exonuclease时，稀释使用会产生完全消化的产物和未消化的底物的混合物。 3.Exonuclease I能否与双链核酸外切酶一起使用来清理质粒制剂？ Exonuclease I可与Lambda Exonuclease一起使用以清理质粒制备物。核酸外切酶III和T7核酸外切酶也有效，但会损坏有缺刻的质粒。虽然可以使用核酸外切酶I，但我们建议在质粒制备后使用核酸外切酶V (RecBCD)去除染色体DNA。 参考文献： 1.Little JW. J Biol Chem. 1967 Feb 25;242(4):679-86. 2.Mitsis PG, Kwagh JG. Nucleic Acids Res. 1999 Aug 1;27(15):3057-3063.