重组SENP2蛋白酶(His-tag)

R752159-50KU

50KU

EnzymoPure™

≥95%(SDS-PAGE)

产品介绍 ： 阿拉丁生产的重组SENP2蛋白酶(His-tag)，即Recombinant SENP2 (His-tag)或rSENP2 (His-tag)，是一种通过 E.coli重组表达的包含人源SENP2的酶活结构域(Asp364-Leu589)和His标签的蛋白酶，理论分子量为26.8kDa，常用于体外去SUMO化修饰(DeSUMOylation)反应，或切除融合表达的重组蛋白的SUMO1、SUMO2或SUMO3标签。rSENP2不识别特定的氨基酸序列，而是高度特异性地识别人源SUMO1/2/3三维结构特征，并在其尾部QTGG/X氨基酸残基之间进行高效酶切，释放成熟形式的SUMO1/2/3，可用于体外去SUMO化修饰反应或移除融合表达的重组蛋白的SUMO标签。本产品N端带有His-tag，可以通过相应的抗体检测或通过镍柱吸附去除。 类泛素蛋白修饰分子，也被称为泛素样修饰因子小蛋白、泛素样小分子修饰因子或小泛素相关修饰物，是一个广泛存在于真核生物的蛋白家族。在人体中共有4种SUMO：SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4，长度约100aa，理论分子量约12kDa，在氨基酸水平SUMO1与SUMO2的相似度为43%，SUMO2与SUMO3的相似度为96%，SUMO2与SUMO4的相似度为87% 1]。与泛素化(Ubiquitination)类似，SUMO通过类泛素蛋白(Ubiquitin-like proteins, Ubls)活化酶(Ubl activating enzyme, E1)、结合酶(Ubl conjugating enzyme, E2)和连接酶(Ubl protein ligase, E3)共价连接到特定蛋白的赖氨酸上，这一过程被称为SUMO化修饰(SUMOylation)。SUMO化修饰是一种翻译后修饰，参与细胞的调控，如细胞内转运、转录调控、细胞凋亡、蛋白质稳定性、压力应激和细胞周期等的调控等2]。 人体中共有7种SENPs (Sentrin-specific proteases)：SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6、SENP7和SENP8，其中SENP8作用于泛素家族成员NEDD8，其余6种SENPs可以识别、切割并释放成熟形式的SUMO1/2/3用于SUMO化修饰，也可以去SUMO化修饰，即将连接到特定蛋白赖氨酸上的SUMO1/2/3切除(图1) 3]。阿拉丁的SUMO Protease 是一种来自 Saccharomyces cerevisiae的高活性的半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl protease) Ulp1 (Ubiquitin-like protein-specific protease 1)基因片段的重组表达蛋白，可以水解SUMO羧基端(C端) x-Gly-Gly-x肽段中Gly-Gly后的肽键，和本产品识别的SUMO标签有所不同，不能相互替换。同时本产品和SUMO Protease 也都不能切割SUMOEU1标签。图1. 人源SENPs加工处理SUMO1/2/3和去SUMO化修饰示意图。SUMO3标签(SUMO3-tag)融合于目的蛋白N端已广泛应用于大肠杆菌体系的重组蛋白表达纯化，SUMO3标签作为分子伴侣辅助融合目的蛋白的折叠，增加重组蛋白的表达量，改善溶解性，保护目的蛋白不被降解。SUMO3标签与GST (Glutathione S-transferase)、MBP (Maltose binding protein)、Trx (Thioredoxin)、NusA (Transcription termination anti-termination factor)和DsbA (Protein disulfide isomerase I)等常用融合标签相比体积更小，而且不需要在融合标签和目的蛋白之间添加TEV (Tobacco etch virus)、EK (Enterokinase)或IIa (Thrombin)等蛋白酶酶切位点。SUMO3标签三维结构可以被rSENP2高特异性地识别，并在其尾部2个连续的Gly氨基酸残基处高效酶切，从而释放融合表达的目的蛋白，便于SUMO3标签的移除4,5]。阿拉丁生产的重组SENP2蛋白酶(His-tag)酶切SUMO3标签融合蛋白的效果参考图2。重组SENP2蛋白酶(His-tag) 酶切SUMO3标签融合蛋白的效果图。在20μl反应体系中，加入10µg SUMO3标签融合蛋白及1μl经100倍稀释的重组SENP2蛋白酶(His-tag)，37℃孵育1小时后，加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) ，混匀后95℃加热5分钟，使用UltraBio™ Plus PAGE预制胶进行电泳检测并使用UltraBio™考马斯亮蓝超快染色液染色。实际效果会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。本产品的基本信息如下表： rSENP2最佳酶切温度为37℃，在较宽的pH范围(6.0-10.0)，较宽的温度范围(2-37℃)，较宽的离子强度范围(0-1M NaCl，0-500mM Imidazole)内均具有较高的酶活性。在实际操作过程中，建议4℃酶切过夜以尽可能保持重组蛋白的活性。rSENP2在0.5-2mM DTT存在的情况下酶活性更高，建议酶切体系中加入适当浓度的DTT以提高酶切效率。 rSENP2的酶活性不会被常见的丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitor)如PMSF、AEBSF、Bestatin、Pepstatin、E-4、TLCK和EDTA所抑制。但靶向半胱氨酸(Cysteine)残基的蛋白酶抑制剂如NEM或IAA等，可以显著抑制rSENP2的酶活力。本产品用于移除重组蛋白SUMO3标签酶切反应时，如果按照1mg SUMO3标签融合的重组蛋白使用1μl rSENP2 (100U/μl)在4℃酶切过夜，本产品的500U、2KU、10KU和50KU包装，分别可用于约5mg、20mg、100mg和500mg带有SUMO3标签融合重组蛋白的酶切。 注意事项 ： 本产品含50%甘油，-20℃保存不会冻结。须避免-80℃保存，冻融可能会降低本产品的酶活性。 本产品较为粘稠，吸取时需注意取样量准确，加样后请注意充分吹打混匀，避免产生气泡。请仔细核对所使用的SUMO标签是否适合本产品。不同的SUMO标签可能需要使用不同的相应蛋白酶的。本产品的酶活性与SUMO3标签和目的蛋白形成的融合蛋白的空间结构有较大的相关性，实测对于一些SUMO3标签融合蛋白的活性可以达到说明书标注的活性，但对于某些UMO3标签融合蛋白的酶切活性会差别比较大。对于遇到本产品酶活性相对较低的情况，需要大幅度加大酶的用量。如果希望获得更高的酶切活性，此时建议在许可的范围内适当增减目的蛋白与SUMO3标签连接处的氨基酸序列，以获得更好的酶切效果。本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明 ： 1.酶切条件的优化：由于不同SUMO3标签融合的重组蛋白具有不同的特性，为获得比较理想的实验效果，建议对酶和待酶切的SUMO3标签融合蛋白的使用比例进行适当优化，按照如下步骤摸索rSENP2的理想用量。a.取1μl rSENP2 (100U/μl)加入到99μl Reaction Buffer (需用户自备)中，将rSENP2稀释至1U/μl。注：由于rSENP2在较宽的pH范围(6.0-10.0)，较宽的温度范围(2-37℃)，较宽的离子强度范围(0-1M NaCl，0-500mM Imidazole)内均具有较高的酶活性，因此对Reaction Buffer组分不作特定限制，但是在0.5-2mM DTT存在的情况下rSENP2的酶活性更高，可根据实验需要决定酶切体系中是否加入适当浓度的DTT。b.请参考下表在1.5ml离心管中配制反应体系。ComponentVolumeSUMO3-tag Protein (10μg)xμlrSENP2 (1U/μl)0, 1, 5 or 10μlReaction BufferTo 20μlc.进行酶切反应。温度与时间可以视情况进行适当调整，具体请参考下表。TemperatureTime4℃overnight16℃4h25℃2h37℃1hd.加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) ，混匀后95℃加热5分钟，使用 Plus PAGE预制胶进行电泳检测并使用考马斯亮蓝染色。e.观察考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，SUMO3标签被完全切除是比较理想的rSENP2酶用量，可按照等比例放大应用到后续的酶切反应中。f.如按照上述操作，SUMO3标签没有被完全切除，可以尝试增加rSENP2酶用量，延长酶切时间或提高酶切温度，以获得最佳的酶切效果。2.酶切与纯化。后续可以按照上述优化的反应条件，放大反应体系进行目的蛋白SUMO3标签的切除反应。反应结束后，可以通过镍柱结合去除切除下来的带有His标签的SUMO标签，以及带有His标签的本产品重组SENP2蛋白酶，从而获得高纯度的去除了SUMO标签的目的蛋白。也可以对于同时带有His标签的SUMO3标签的融合表达蛋白进行在柱酶切，即在镍柱或GST柱结合带有His标签的SUMO3标签的融合蛋白时，进行rSENP2 (His-tag)的酶切，酶切后如果镍柱容量足够，rSENP2 (His-tag)和酶切下来的带有His标签的SUMO3标签都会结合在镍柱上，仅目的蛋白会被洗脱下来。参考文献：1.Reverter D, Lima CD. Nat Struct Mol Biol. 2006. 13(12):1060-8.2.Hay RT. SMol Cell. 2005. 18(1):1-12.3.Nayak A, Müller S. Genome Biol. 2014. 15(7):422.4.Marblestone JG, Edavettal SC, Lim Y, Lim P, Zuo X, Butt TR. Protein Sci. 2006. 15(1):182-9.5.Butt TR, Edavettal SC, Hall JP, Mattern MR. Protein Expr Purif. 2005. 43(1):1-9. Aladdin's Recombinant SENP2 (His-tag), also named as rSENP2 (His-tag), is a protease containing the activity domain (Asp364-Leu589) of human SENP2. It is recombinantly expressed in E. coli, with a His tag and a theoretical molecular weight of 26.8 kDa. It is commonly used for in vitro DeSUMOylation or excision of SUMO1, SUMO2 or SUMO3 tags from recombinant fusion proteins.Instead of recognizing a specific amino acid sequence, rSENP2 specifically recognizes the three-dimensional structures of human SUMO1/2/3 and efficiently cleaves the QTGG/X amino acid sequence at their termini to release the mature form of SUMO1/2/3.This product is fused with a N-terminal His tag. It can be detected with the specific antibody or be removed using a nickel column. Small ubiquitin-like modifier (SUMO) is a protein family ubiquitous in eukaryotes. There are four classes of SUMO in human Precautions ： This product contains 50% glycerol and will not freeze at -20°C. Storage at -80°C should be avoided as freeze-thaws may reduce the enzymatic activity of this product.This product is viscous. Make sure the exact amount is taken. Mix after adding it to solutions by gentle pipetting and avoid the formation of air bubbles.The enzymatic activity of this product is largely impacted by the spatial structure of proteins fused with SUMO tag. For cases where the enzymatic activity is relatively low, the amount of enzyme should be increased significantly. To obtain higher enzymatic activity, manipulating the amino acid sequence between SUMO tag and target protein can be attempted.This product is for R&D only. Not for drug, household, or other uses.For your safety and health, please wear a lab coat and disposable gloves during the operation. Instructions for Use ： 1. Optimization of digestion conditions. The ratio of enzyme to tagged protein should be optimized for different SUMO3-containing proteins as follows:a. Add 1μl of rSENP2 (100U/μl) to 99μl of Reaction Buffer and mix well. Reaction Buffer is not supplied in this product.Note: As rSENP2 is highly active over a wide pH (6.0-10.0), temperature (2-37ºC), and ionic strength (0-1M NaCl, 0-500mM Imidazole), there is no specific restrictions on the components of Reaction Buffer. The enzymatic activity of rSENP2 is higher in the presence of 0.5-2mM DTT, so the addition of appropriate amount of DTT to the reaction can be considered for experimental needs. b. Set up the reaction in a 1.5ml centrifuge tube as follows:ComponentVolume SUMO3-tag Protein (10μg) xμl rSENP2 (1U/μl) 0, 1, 5 or 10μl Reaction Buffer To 20μl c. Incubate the reaction. Please refer to the following table for incubation temperature and time.Temperature Incubation Time 4℃ overnight 16℃ 4h 25℃ 2h 37℃ 1h d. Add 4μl of SDS-PAGE Sample Loading Buffer (6X) ( Coomassie Blue Super Fast Staining Solution (, P0017F).e. Observe proteins in the SDS-PAGE gel. The ideal amount of rSENP2 is that can just completely excise the SUMO3 tag. The reaction system can be scaled up or down proportionally.f. If the SUMO3 tag is not completely excised, increasing the amount of rSENP2, the digestion time or the reaction temperature can be attempted.2. Enzymatic digestion and purification. With the optimal digestion conditions, the reaction system can be scaled up to remove the SUMO3 tag from the target protein. After desumoylation, the excised SUMO3 tag with His tag and the rSENP2 with His tag can be removed by the nickel column, and the high-purity target protein without SUMO3 tag can be obtained. It is also possible to perform on-column digestion of fusion proteins with both His-tag and SUMO3 tag. If the capacity of the nickel column is sufficient, both rSENP2 (His-tag) and the cleaved SUMO3 tag with His-tag will be bound to the nickel column while only the target protein will be eluted.